之后，慈禧太后和慈安太后在热河秘密召见恭亲王奕欣，三人经过一番商议，决定发动政变，夺取政权。奕欣回到北京后，积极拉拢同盟，四处传播对八大臣不利的言论，为政变制造舆论氛围。同时，慈禧太后以“减其劳”为名，巧妙地解除了八大臣之一载垣领禁卫军的兵权，削弱了八大臣的军事力量。
一切准备就绪后，慈禧太后带着同治皇帝提前由小路赶回北京，而让八大臣中最有权力的肃顺护送咸丰梓宫走大路。
11月1日，慈禧太后回到北京后，立刻接见恭亲王奕欣和军机大臣文祥等人。
11月2日，在慈禧太后的授意下，奕欣颁布圣旨，解除肃顺等人的职务，并当场逮捕载垣、端华。随后，又命令将景寿、穆荫、匡源、杜翰、焦佑瀛等撤职查办，还派人抓捕护送梓宫回京的肃顺。
11月8日，慈禧太后发布诏书，公然否认咸丰帝的遗诏，数落八大臣的种种罪状，最终将肃顺斩首，让载垣、端华自尽，其他五大臣则被革职或充军。
12月2日，载淳正式登基，两宫太后开始垂帘听政，慈禧太后还宣布废除八大臣原拟的祺祥年号，改为同治元年，并让恭亲王奕欣辅政，形成了“太后垂帘，亲王辅政”的统治局面。
在这场政变中，慈安太后选择支持慈禧太后，一方面是因为八大臣的嚣张跋扈让她感到气愤，他们不把孤儿寡母放在眼里，甚至“擅坐御位”，这种行为严重挑战了皇室的权威；
另一方面，慈安太后也希望通过与慈禧太后合作，为同治帝亲政提前清除障碍，确保同治帝能够顺利掌握政权。辛酉政变的成功，标志着慈禧太后迈出了掌握权力的关键一步，也为她日后的政治生涯奠定了坚实的基础。
垂帘听政初期，慈安太后和慈禧太后在一定程度上进行了合作，共同治理国家。她们整顿吏治，破格重用以曾国藩为首的湘军集团和其他地方的汉人军事集团。