骑士团直到1530年才拥有自己的领土，当时大团长菲利普·德·维利耶（Fra' Philippe de Villiers de l'Isle Adam）占领了马耳他岛（Malta）。
该岛是由神圣罗马皇帝查理五世和他的母亲卡斯蒂利亚女王琼娜（Queen Joanna of Castile）以西西里国王的身份授予骑士团的，得到了教皇克莱门特七世（Pope Clement VII）的批准，骑士团因此需遵守《马耳他猎鹰的贡品》（Tribute of the Maltese Falcon）的条件。
在1565年，骑士们在大团长让·德·瓦莱特（Fra' Jean de Valette，曾在土耳其船上和德拉古特一起划桨）的领导下，成功防御了奥斯曼帝国的围攻，持续了三个多月。
骑士团的舰队在1571年的莱班托海战（Battle of Lepanto）中对奥斯曼海军力量的最终摧毁做出了贡献，该战役由西班牙国王菲利普二世（King Philip II of Spain）的异母兄弟奥地利的约翰（John of Austria）指挥。
宗教改革将西欧分裂为新教和天主教国家，对骑士团也产生了影响。
在包括英格兰、苏格兰和瑞典在内的多个国家，骑士团解散。
在其他国家，如荷兰和德国，部分司法区或指挥部（骑士团的行政区划）经历了新教转变。
这些“约翰骑士团”在德国、荷兰、瑞典以及包括美国和南非在内的许多其他国家存续下来。
骑士团被确立为在任何基督教国家之间的战争中保持中立。
从1651年到1665年，骑士团统治了加勒比海的四个岛屿。
在1651年5月21日，它购买了圣巴瑟米岛（Saint Barthélemy）、圣基督山（Saint Christopher）、圣克鲁瓦岛（Saint Croix）和圣马丁岛（Saint Martin）。
这些岛屿是从刚刚解散的法国外岛公司（Compagnie des ?les de l'Amérique）手中购买的。
到1665年，这四个岛屿被出售给了法国西印度公司（French West India Company）。
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1798年，拿破仑领导法国占领马耳他。
拿破仑要求大团长费迪南德·冯·霍姆佩施·祖·博尔海姆（Ferdinand von Hompesch zu Bolheim）允许他的舰船进入港口，补给水和物资。
大团长回复说，每次只能允许两艘外国船只进入港口。
拿破仑意识到这一程序将耗费时间，令他的军队暴露在英国海军上将霍雷肖·纳尔逊（Admiral Horatio Nelson）面前，于是立即下令对马耳他发起炮击。