2001年，出演青春电影《十七岁的单车》，在片中饰演美丽的富家女高中生Xiao。 2002年5月，参演都市爱情电影《开往春天的地铁》。
2003年，主演根据金庸同名小说改编的古装武侠爱情剧《倚天屠龙记》，这是高圆圆首次挑战古装武侠剧，其在剧中饰演的女主人公周芷若，本是温柔内敛、柔弱怜人的美丽少女，却在经历一系列变故后，成为了性格阴冷，工于心计的峨眉派第四代掌门人，该剧首先在台湾华视首播，收视率一直维持在AC-尼尔森指数6以上，最高值接近7，而后在内地播出后，最高收视率曾达到26%； 10月，主演古装悬疑剧《护国良相狄仁杰》，饰演武功高强且个性率直的女孩潘玉。
2004年主演电视剧《海的誓言》；7月，主演青春都市剧《你在微笑我却哭了》，饰演高三女学生沈笑，这是高圆圆最后一次出演中学生角色； 10月，在古装魔幻爱情剧《神医侠侣》中饰演集千般宠爱于一身的公主琴子。
2005年2月，主演古装剧《秦王李世民》，饰演美丽善良且敢爱敢恨的隋朝公主若惜 ；5月，开始改变以往在银幕上单一的清纯形象，主演的剧情片《青红》入围第58届戛纳电影节竞赛单元，她在片中饰演女主人公青红 ；9月，高圆圆在百合小姐选拔赛中获得了首届中国“百合小姐”称号 ；10月，与李亚鹏、霍建华合作主演武侠剧《天下第一》，饰演表面柔弱、实则心机城府深重的冷血杀手柳生飘絮 。
2006年9月，与成龙、古天乐合作主演喜剧动作片《宝贝计划》，高圆圆凭借在片中饰演宝贝育婴师Melody一角而入围百花奖最佳女演员提名 。2007年1月，与余文乐合作主演爱情电影《男才女貌》，高圆圆凭借聋哑幼师秦小悠一角获得第11届电影表演艺术学会奖新人奖 ；10月，主演悬疑惊悚剧《第三个人》，饰演绝症晚期患者肖可 。
2008年4月，在历史题材电影《南京！南京！》中饰演归国女教师姜淑云 ，这一角色对高圆圆有着重要的影响，由于长达一年的时间围绕这部令人感到压抑电影，使其一度患上抑郁症，而摆脱抑郁的情绪后其人生观也因此电影而改变；9月，主演苦情励志剧《爱无悔》，在剧中饰演靠自己的努力重振家业的高明月 。