2000年，以优异成绩毕业的佟丽娅被分配到新疆歌舞团担任舞蹈演员；2月，佟丽娅参加了新疆电视台的春节联欢晚会；随后，她还考入了新疆艺术学院舞蹈学院舞蹈教育专业，并利用业余时间担任电视广告和摄影模特，以及在新疆丽燕舞蹈学校、乌鲁木齐市青少年宫担任舞蹈教师；同年，刚刚17岁的佟丽娅便获得了新疆舞蹈家协会的四级舞蹈考级培训教师资格 。
2001年3月，佟丽娅被借调到马兰基地参加总装备部文艺调演；随后，她还赴山东潍坊进行了近三个月的实习演出；6月，佟丽娅参与了香港卫视中文台申奥宣传片的拍摄；9月，她跟随新疆歌舞团参加了全国少数民族文艺汇演，并担任锡伯族舞蹈《喜上眉梢》的女领舞，最终她则在这次汇演中获得了表演三等奖的荣誉 。
2002年6月，佟丽娅参加了首届新疆小姐选美大赛，而她在比赛中则获得了亚军的不俗成绩；随后，她还参加了全国影视新人选拔大赛，并最终在比赛中获得了金奖的荣誉；8月，佟丽娅随中央电视台《同一首歌》节目参加了一系列的文艺演出；10月，佟丽娅被借调到中国歌舞团一分团近半年，在此期间她则参加了歌舞节目《秘境之旅》的演出。
2003年1月，佟丽娅参加了中国中央电视台西部频道《魅力西部》春节特别节目，并在节目中表演了舞蹈《楼兰姑娘》、《花儿为什么这样红》、《玛露夏》等；2月，她随新疆艺术学院青年艺术团赴香港进行了演出活动；随后，佟丽娅还获得了新疆艺术学院舞蹈专业的单项奖学金。
2004年，佟丽娅被中国歌舞团录用，担任旗下的舞蹈演员，而她则在这一年的文化部春节电视晚会上表演了维吾尔族独舞《巴郎仔》、群舞《神秘面纱》等；同年，佟丽娅以优异的成绩被中央戏剧学院表演系本科表演专业录取，同时也成为了第一个考入中央戏剧学院表演专业的新疆锡伯族学生；此外，她还担任了王宏伟《喀什噶尔女郎》音乐录影带的女主角。2005年，日本富士电视台拍摄的纪实性电视专题片《追梦的人》对佟丽娅进行了专题介绍 。
2006年，佟丽娅在中央戏剧学院大二在读期间便出演了尔冬升执导的现代情感剧《新不了情》 ，其在剧中饰演了外形漂亮、声音优美且气质卓群的青年李再爱 ，而佟丽娅也自此正式踏入影视领域 ；同年，她还完成了个人的首部电影作品《葵花子》。
2007年，佟丽娅出演了中央戏剧学院的现代话剧《蝴蝶是自由的》；同年，她还领衔主演了现代青春爱情剧《空巷子》，并在剧中饰演了命运多舛的美丽女孩齐乔，而这也是其首次在影视剧中饰演女主角 ；此外，佟丽娅还出演了现代缉毒剧《红蝎子》。