不久，叶向高被提拔为南京礼部右侍郎，后又改任吏部右侍郎。在新的岗位上，叶向高并未放弃对矿税问题的关注。他再次上疏，直言矿税对民生的负面影响，并特别呼吁罢免辽东税监高淮，认为此人滥征税款，激化了民变的风险。叶向高的言辞恳切，充满了对百姓疾苦的深切同情和对国家长治久安的忧虑。
然而，叶向高的直言不讳并未赢得所有同僚的支持。在妖书案——一场涉及政治权力斗争的事件中，叶向高致信内阁大学士沈一贯，力劝其采取更为审慎的态度处理此案。沈一贯对叶向高的介入感到不悦，这导致叶向高在南京的九年间未能得到进一步的晋升，反映出当时政治氛围的复杂性，以及直言谏议者面临的潜在风险。
三、唯一宰辅
万历三十五年（1607年），随着沈一贯的罢免和朱赓的专权，明神宗决定扩充内阁，叶向高因此被擢升为礼部尚书兼东阁大学士，成为内阁的一员。然而，不久之后，于慎行去世，王锡爵拒绝任职，加上朱赓的离世和李廷机的长期避世，叶向高便成了唯一的辅臣，肩负起了整个朝廷的重担。
叶向高担任首辅期间，面临着前所未有的政治挑战。明神宗在位日久，逐渐失去了勤政的热情，国家政务陷入了停滞状态，许多重要官职空缺，人事任命停滞不前，君臣之间的沟通几乎中断。与此同时，廷臣之间形成了错综复杂的党争，宦官征税、开矿，加剧了社会矛盾，百姓生活困苦。
在这样的背景下，叶向高以他的德行和能力，成为朝堂上的一股清流。他忧国忧民，每遇政事必尽心尽力，试图弥补君臣之间的鸿沟。尽管神宗对他礼遇有加，但对他的建议却往往置若罔闻，甚至对东宫太子恢复讲学的请求也屡次不予理会，叶向高只得每年春秋两季持续恳求，但收效甚微。
更令人担忧的是，太子生母王贵妃病逝后，神宗迟迟不愿发丧，直至叶向高反复劝谏才有所行动。同样，福王的回封国事宜也是一波三折，神宗先是答应让福王于次年春季回封，后又突然更改条件，要求福王的庄田达到四万顷才准许回封，此举引起了朝臣们的强烈反对。叶向高深知此规定既无先例，也违背祖制，且会损害皇室信誉，因此他极力劝谏，指出福王久居京城可能引起太子地位的不稳定，恳请神宗遵守诺言。